1 Che cos’è

Il normale chitosano è un polisaccaride derivato dalla chitina. La chitina si trova, in natura, nel plancton e nell’esoscheletro dei crostacei (granchi, aragoste, gamberetti, etc.). La molecola del chitosano è ottenuta da quella della chitina tramite deacetilazione, ovvero rimozione dei gruppo acetilici presenti in posizione 2 (vedi figura 2). Strutturalmente, quindi il chitosano è rappresentato da una catena di molecole di (b-(1®4)-D- glucosio caratterizzate dal possedere gruppi aminici in luogo degli idrossili in posizione 2 come descritto dalla formula Poli(b-(1®4)-2-amino-2-deossi-D-glucosio).

Il chitosano oligosaccaridico sale della vitamina C, rappresenta un’innovazione sul fronte dei chitosani. La sua molecola, che si presenta in forma di ascorbato (sale della vitamina C), ha dimensioni e peso molecolare ridotto ed è completamente idrosolubilile. Viene ricavato a partire dal normale chitosano (polisaccaridico) mediante un complesso processo di trasformazione che utilizza un enzima multifunzionale conosciuto col nome di chitosanasi-KPB. (vedi figura 1).

2 Proprietà

Il chitosano oligosaccaridico sale della vitamina C possiede alcune caratteristiche funzionali e tecnologiche che lo differenziano dal normale chitosano e lo rendono una molecola versatile e innovativa (vedi tabella 1).

Le proprietà attribuibili al chitosano oligosaccaridico sale della vitamina C possono essere riassunte come segue:

Þ Attivazione del sistema immunitario (8, 11, 12, 13, 17, 20).

Þ Promozione della crescita della flora intestinale batterica, es. Bifidobacterium (2).

Þ Riduzione dei tassi di lipidi e colesterolo ematico (3, 15, 16).

Þ Attivazione della funzione epatica (3).

Þ Attività antibatterica (8, 11, 14a, 20)

Þ Azione anticancerogena (1, 6, 7, 8).

Þ Prevenzione e/o cura dell’ipertensione (3, 9).

Þ Prevenzione nei confronti della diarrea e della stitichezza, regolarizzazione della funzionalità intestinale (9, 17, 18).

Þ Prevenzione dei disturbi correlati al sovra-consumo di alcol (3, 18, 19)

La forma di ascorbato (sale della vitamina C) conferisce alla molecola del chitosano oligosaccaride numerosi vantaggi di tipo sia applicativo che tecnologico. Come è noto, infatti, la presenza di vitamina C apporta potere antiossidante, nonché promuovente nei confronti del metabolismo cellulare, della ricostruzione tessutale (sintesi del collagene), dell’assorbimento del ferro, etc. Dal punto di vista tecnologico, si ottengono invece notevoli vantaggi in termini di termostabilità (vedi figura 2).

2.1 Attivazione del sistema immunitario

L’azione di stimolazione del sistema immunitario esercitata dal chitosano oligosaccaridico sale della vitamina C si esplica su vari fronti. Ad esso possono essere infatti attribuite proprietà anticancerogene, probiotiche, antimicrobiche e stimolanti nei confronti della funzionalità epatica.

In alcuni studi condotti su topi BALB/c è stato osservato come la somministrazione di dosi superiori a 1 mg/kg di chitosano oligosaccaridico sia stata in grado di inibire la crescita di un particolare tipo di tumore (Meth-A). Il meccanismo coinvolto secondo questo studio sembra essere quello di un incremento della produzione di linfochine, comprese le interleuchine 1 e 2, e della conseguente proliferazione dei linfociti-T (1).

Un’azione di questo tipo è stata confermata anche dai risultati ottenuti in un altro studio, sempre condotto su topi BALB/c, nel quale la somministrazione di chitosano oligosaccaridico ha contribuito ad incrementare le difese immunitarie, in particolare l’azione di contrasto esercitata da interferone-g (IFN-g) e interleuchina 2 (IL-2) nei confronti della crescita del batterio Listeria monocitogenes (11). Risultati simili sono stati ottenuti nei topi anche nei confronti della specie batterica Pseudomonas aeruginosa (20). In un caso è stato verificato come la somministrazione intraperitoneale di 50 mg/kg di chitosano oligosaccaridico nei topi abbia incrementato la generazione di ossigeno attivo e di conseguenza anche il potere difensivo degli organismi trattati (topi BALB/c) nei confronti del genere Candida albicans (8).

L’azione anticancerogena del chitosano oligosaccaridico è stata dimostrata in numerosi studi condotti su animali, in particolar modo su topi. Sono state studiate diverse forme di tumore (sarcoma 180, MM46, carcinoma polmonare di Lewis, etc) (1, 6, 7, 8).

Da due interessanti studi a doppio cieco condotti su topi è emerso come l’assunzione di chitosano oligosaccaridico possa esercitare un’azione coadiuvante nei confronti della funzionalità epatica (6, 3). Nel primo di questi studi (6), è stato dimostrato come la somministrazione di chitosano oligosaccaridico abbia significativamente ridotto, rispetto al gruppo di controllo, i danni provocati a livello tessutale ed organico dal potente epatotossico CCl₄. Nel secondo (3), è stata rilevata invece una diminuzione significativa di alcuni parametri indici del danneggiamento epatico conseguente alla somministrazione di dosi massicce di etanolo (necrosi, infiammazioni, accumulo di lipidi), nonché un parallelo decremento dell’attività dell’enzima GTP (glutamic-piruvic transaminase) (vedi tabella 2).

Tabella 2: effetti della somministrazione del chitosano sale della vitamina C su: assunzione di cibo (food intake=FI), incremento di peso corporeo (gain in weight=GW sul peso corporeo BW=body weight), peso del fegato (liver weight=LW) ed attività della GPT plasmatica (confronto con fegato iperlipidico indotto da sovradosaggio di etanolo) (3).

	Controllo	Chit. Sale VitC + Etanolo	Etanolo
FI (g/die)	11,0±2,4a	10,5±2,2a	8,5±3,5a
GW (BW)(g)	20,53±5,31a	19,98±1,74a	28,12±2,78b
LW (g fegato/100 g BW)	4,76±0,83a	4,71±0,91a	4,13±0,05a
GPT (Kamen unit/ml)	26,67±2,89	36,25±2,63b	48,33±2,89c

Per il momento, purtroppo, i dati che riguardano l’immunostimolazione derivata dall’assunzione di chitosano oligosaccaridico sono ancora pochi e coinvolgono un numero limitato di soggetti. I risultati emersi da tali studi pilota risultano comunque piuttosto incoraggianti.

Un’interessante sperimentazione a doppio cieco condotta su 15 soggetti umani in buona salute (6 uomini 9 donne di età media pari a 26 ± 4,6 anni) ha valutato, ad esempio, l’effetto in termini di immunoattivazione (= misurato come aumento dell’attivazione delle cellule NK) provocato dalla somministrazione orale di una singola dose di chitosano oligosaccaridico (1000 mg). Dai risultati emersi, è stato possibile riscontrare un livello di immunoattivazione significativamente superiore nei soggetti trattati con il chitosano oligosaccaridico rispetto a quelli appartenenti al gruppo di controllo già dopo 6 e 9 ore (13).

In uno studio condotto su soggetti giovani (bambini sottopeso ed immunodepressi) è stato dimostrato come la somministrazione di chitosano oligosaccaridico abbia condotto ad un incremento ponderale soddisfacente (se rapportato alle medie nazionali) già dopo tre mesi di trattamento. In tale periodo non sono stati osservati tutti i sintomi che normalmente accompagnano le disfunzioni correlate alla presenza di scarse difese immunitarie (es: stichezza o diarrea, vomito, febbre, influenza, etc.) (17). In altre sperimentazioni condotte su volontari sono stati osservati significativi miglioramenti riguardo a funzionalità intestinale, menorralgia, nonché a quella sintomatologia che compare il giorno successivo all’assunzione di un’elevata quantità di alcool (mal di testa, nausea, vomito, diarrea, nervosismo, insonnia, spossatezza, etc) (18, 19).

2.1 Riduzione del livello di colesterolo e trigliceridi nel sangue

La riduzione del tasso ematico di colesterolo e di trigliceridi è ottenuta dal chitosano oligosaccaridico mediante un meccanismo differente da quello utilizzato dal chitosano normale (polisaccaridico). Mentre, infatti, il chitosano polisaccaridico riduce fisicamente l’assorbimento dei grassi introdotti con la dieta, il chitosano sale della vitamina C può essere assorbito ed agire a livello sistemico, garantendo un’efficacia più duratura. Inoltre, il chitosano oligosaccaridico non comporta la diminuzione dell’assorbimento di alcuni importanti micronutrienti, quali le vitamine liposolubili ed i minerali, come accade invece per il chitosano polisaccaridico.

E’ noto come valori alti di colesterolemia e trigliceridemia non derivino soltanto dalla quantità di grassi animali introdotti con la dieta, ma anche da fattori genetici, legati all’età, al sesso, allo stile di vita (sedentaria o meno), alla glicemia, all’assunzione di alcool ed al fumo di sigaretta. In questo ambito è comprensibile come la modalità d’azione più efficace e completa sia quella che vada a coinvolgere più dall’interno la modulazione dei livelli plasmatici di colesterolo e trigliceridi. Sembra che le dinamiche coinvolte nell’azione ipolipidemizzante ed ipo-colesterolemizzante del chitosano oligosaccaridico facciano appello ai seguenti processi:

ü Controllo della sintesi epatica di acidi biliari.

ü Azione coadiuvante della digestione tramite facilitazione della secrezione degli acidi biliari.

ü Regolarizzazione della funzionalità intestinale mediante l’esercizio di un’azione di controllo della secrezione acida epatica ed attivazione della flora batterica probiotica.

Particolarmente interessanti sono a questo proposito i risultati ottenuti in uno studio condotto su topi (3) nel quale, oltre ai parametri relativi alla funzionalità epatica, sono stati determinati, in funzione del dosaggio del chitosano sale della vitamina C somministrato, anche la colesterolemia totale (TC), quella HDL ed i trigliceridi (TG) (vedi tabella 3).

Tabella 3: effetti di un ciclo di somministrazione di 0,05; 0,125 e 0,25 g/kg BW di chitosano sale della vitamina C per 28 giorni su ratti maschi Wistar. Dai risultati è possibile notare come, mentre all’interno di ogni gruppo di dosaggio il livello di colesterolo HDL non è variato significativamente, i livelli serici di colesterolo totale (TC) e trigliceridi (TG) sono diminuiti significativamente (P<0,05) (3).

Dosaggio Chitosano sale vit. C (g/kg BW)	TC (%)	TG (%)	HDL (mg/dl)
0,05	-9,9	-19,7	-
0,125	-15,1	-23,3	-
0,25	-23,6	-17,0	+0,2

3 Tossicologia

In seguito all’effettuazione di studi tossicologici mirati è stato possibile determinare alcune importanti caratteristiche farmacologiche del prodotto chitosano oligosaccaride sale della vitamina C (14 a, b, c).

1.1 Attività antimicrobica

ü Prodotto testato: chitosano sale della vitamina C.

ü Mezzo utilizzato: (Glu 0,1%, NaCl 0,2%, Agar 1,8%, pH 7,4).

ü Metodo utilizzato: diluizione a 3 step su piastra di agar per ogni specie batterica testata (0,5 mL di soluzione in 48 pozzetti). Il mezzo è stato concentrato 2 volte per minimizzare l’effetto volumetrico. Il pH è stato portato a 6,5. Concentrazione iniziale della sostanza in soluzione pari a 0,5g/4mL.

I. 0,5 ml (mezzo concentrato 2 volte; pH controllato)+0,25ml (sostanze)-soluzione iniziale diluita 2 volte.

II. 0,5 ml (mezzo concentrato 2 volte; pH controllato)+0,15ml (sostanze)-soluzione iniziale diluita 2 volte.

III. 0,5 ml (mezzo concentrato 2 volte; pH controllato)+0,05ml (sostanze)-soluzione iniziale diluita 2 volte.

	Mezzo	Sostanza Chitosano sale della Vit C	Concentrazione finale (mg/ml)
I	0,25 ml	0,25 ml	62,5
II	0,25 ml	0,15 ml	37,5
III	0,25 ml	0,05 ml	12,5

ü Risultati e discussione: il chitosano sale della vitamina C esercita effetto inibente nei confronti della crescita di alcune specie batteriche come indicato in tabella 4 (14a).

Tabella 4: risultati ottenuti in termini di attività antimicrobica per la sostanza chitosano sale della vitamina C nei confronti di alcune specie batteriche (14a).

Materiali		Sostanza testata Chitosano sale della vitamina C
Batteri		62,5mg/ml	37,5mg/ml	12,5mg/ml
G(+)	Bacillus subtilis	O
	Staphylococcus aureus	O
G(-)	E coli	O	O
	Pseudomonas sp.	O

3.2 Citotossicità

ü Prodotti testati: chitosano sale della vitamina C (ascorbato, 55% in glucosamina), chitosano aspartato (sale organico, 65% in glucosamina), controllo (chitosano oligosaccaride 70%).

ü Linee cellulari utilizzate: normali (BCE-cellule endoteliali capillari bovine); semi cancerogene (ECV304-cellule endoteliali ombelicali umane); cancerogene (U87MG, D54MG-cellule umane di glioblastoma).

ü Risultati: mentre il chitosano oligosaccaride reagisce con MTT (mezzo culturale di tipo tessutale) in alte concentrazioni, non è stato possibile stabilire in modo esaustivo la citotossicità. Nelle linee cellulari tumorali sono state osservate alcune piccole differenze in termini di citotossicità tra le tre sostanze testate (vedi figura 3). Nelle linee cellulari normali, invece, tali differenze non sono state riscontrate. In base ai risultati globali ottenuti, è stato possibile concludere che le sostanze oligosaccaridiche testate non possono essere considerate citotossiche (14b).

3.3 Tossicità acuta

ü Prodotti testati: chitosano sale della vitamina C (ascorbato, 55% in glucosamina), chitosano aspartato (sale organico, 65% in glucosamina), controllo (chitosano oligosaccaride 70%).

ü Animali utilizzati: 20 topi BALB/C di 6 settimane maschi ed altrettanti femmine.

ü Dosaggio: massimo di 10g/kg diluiti in acqua distillata

ü Modalità di somministrazione: orale.

ü Osservazioni: il giorno della somministrazione è stata osservata la sintomatologia generale (stato generale, sintomi di avvelenamento, motilità ed aspetto) ad intervalli di ogni ora per le prime 12 ore. L’eventuale sopraggiungimento della morte dell’animale è stato osservato una volta al giorno a partire dal secondo fino al quattordicesimo giorno. Il peso corporeo è stato misurato tre volte, vale a dire: appena prima della somministrazione e, successivamente, ogni sette giorni.

ü Risultati e discussione: alle dosi testate non sono stati osservati né casi di morte, né sintomi clinici, né cambiamenti significativi in termini di peso corporeo in nessuno dei gruppi di soggetti che hanno partecipato allo studio (14c).

Tabella 1: Specifiche tecniche del chitosano sale della vitamina C idrosolubile

nome commerciale	Chitosano sale della vitamina C idros. ^Ò
Nome generico	Chitosano oligosaccaridico idrosolubile in forma di sale dell’acido ascorbico
descrizione	Polvere di colore giallo chiaro
grado	Alimentare
pH (5% Sol.)	4,0-6,0
solubilita’	pH 3,0-10
viscosita’ (5% Sol)	15 cps
ceneri	Max 0,5%
Arsenico (As)	Max 2 ppm
Metalli Pesanti (Pb)	Max 10 ppm
Peso molecolare	400-2000
Granulometria (passaggio attraverso 80 Mesh)	Min 95,0 %
Cl^-	Max 0,2
Metanolo	Negativo
Total plate count	Max 3000/g
E. coli	Negativo
d-glucosamina	Min 50,0 %

Figura 1: processo attraverso il quale viene ottenuto chitosano sale idrosolubile della vitamina C. La degradazione della molecola polisaccaridica ad unità a più basso peso molecolare (oligosaccaride) avviene mediante utilizzo dell’enzima chitosanasi KBP.

Figura 2: confronto tra la termostabilità della molecola di chitosano sale idrosolubile della vitamina C e quella di altre forme di chitosano oligosaccaridico.

Figura 4 – Effetti del chitosano oligosaccaride sale della vitamina C sulla crescita di Lactobacillus acidophilus nei topi.

Figura 5 – Effetto del chitosano oligosaccaridico sale solubile della Vit C sulla crescita delle specie Bifidobacterium bifidum (probiotica) e Bacteroides (patogeni).

1. Tokoro A, Tatewaki N, Suzuki K, et al. Growth-Inhibitory Effect of Hexa-N-acetylchitohexaose and Chitohexaose against Meth-A Solid Tumor. Chem Pharm. Bull 36(2)784-790 (1988).

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6. Se-Jae Kim, So-Young Kang, Ji-Gweon Park, et al. Effects of Chitooligosaccharides on Carbon Tetrachloride Induced Liver Injury in Rats. Cheju Journal of Life Science, 2(2), 3-10, 1999.

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17. Kunpoong Bio Co Ltd. Clinical experiment for the observation of the effect of Chitosanoligosaccharide on increasing infant’s immunological ability.

18. Kunpoong Bio Co Ltd. Clinical Experiment for the observation of the effect of chitosanoligosaccharide on hangover, menorrhalgia, improving intestinal functions and dietary effect. Available on confidential basis upon request from Kunpoong Bio Co Ltd.

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